Racconto 1: Il Tassolo - Paclitaxel

È una calda giornata d'agosto del 1962, il 21 per la precisione, quando Arthur S. Barclay cammina nella foresta nazionale di Gifford Pinchot, nello stato di Washington.¹ ² Ha appena compiuto trent'anni, un dottorato in botanica preso ad Harvard e un lavoro che dal 1960 lo tiene in viaggio.³ Setaccia specie vegetali, riempie sacchi, annota numeri, ricomincia. Il progetto a cui sta lavorando potrebbe sembrare folle ma ha un obiettivo importante: cercare una promettente molecola antitumorale.

Non si parte da un indizio, né da una teoria, né da un sospetto. L'obiettivo è coprire il ventaglio più largo possibile di famiglie vegetali, e la strategia sul campo è volutamente casuale: si raccoglie tutto quello che è di origine vegetale e si manda a testare.¹

Alla fine degli anni Cinquanta la ricerca americana sul cancro era ormai ben finanziata. Il bilancio del National Cancer Institute era passato da mezzo milione di dollari nel 1937, primo anno di vita, a quattordici milioni nel 1951, e dieci anni più tardi avrebbe toccato i centodieci milioni.¹ Ben finanziata, però, non significava ben organizzata. Fu per rimediare a questo che nel 1955 l'istituto creò il Cancer Chemotherapy National Service Center, per il quale il Senato aveva stanziato cinque milioni di dollari, su pressione dell'attivista Mary Lasker⁴, non un ente che distribuiva fondi, ma un ente pubblico che testava con procedure standardizzate qualunque composto le venisse inviato da aziende e istituti. Nel 1960 passava al setaccio trentamila campioni all'anno, dieci volte il volume dello Sloan-Kettering Institute, che pochi anni prima eseguiva da solo tre quarti di tutti i test antitumorali americani.¹

E fu così che a un'altitudine di 457 metri Barclay si fermò davanti a un gruppo di conifere e ne scelse una, alta poco più di sette metri: il tasso del Pacifico, Taxus brevifolia. È un albero piccolo, che vive all'ombra di conifere giganti sulle rive dei corsi d'acqua, nelle gole profonde e nei burroni umidi, con una corteccia rossastra e sottile e aghi piatti, leggermente curvi, lunghi circa due centimetri.¹ ⁷ C'è poi un aspetto che non è affatto secondario: il tasso è velenoso quasi in ogni sua parte. Radici, legno, corteccia, aghi e semi contengono alcaloidi taxinici; se ingeriti causano alterazioni del ritmo che possono portare a morte per 'arresto cardiaco. L'unica parte innocua è l'arillo, la polpa rossa e carnosa che avvolge il seme.⁵

Fin dagli albori della storia l'uomo ha usato il tasso, e quasi sempre per uccidere. Gli antichi Egizi ne ricavavano utensili domestici e armi, i Celti utensili e armi, e a Omero si fa risalire una delle prime menzioni letterarie di archi di tasso. I Romani, che ne conoscevano bene la tossicità, ne usavano i rami nelle cerimonie funebri, e i Greci lo ritenevano sacro a Ecate, dea degli inferi. Il nome scientifico stesso, taxus, somiglia in modo inquietante alle parole greche arco e veleno, toxon e toxicon.¹

Sul tasso del Pacifico, invece, la scienza non si era quasi mai interessata. Cambiò tutto negli anni Sessanta.

Il campione di Barclay portava il nome di B-1645, il 1645° campione della sua carriera, e ne raccoglie due lotti distinti: PR-4959, rami e frutti, e PR-4960, rami e corteccia.¹ Della corteccia del fusto raccoglie circa 340 grammi.⁸ Non sa di aver appena avviato una delle cacce al tesoro chimiche più complesse del XX secolo.

Il sacco di Barclay arriva alla Wisconsin Alumni Research Foundation, dove il materiale viene macinato e messo a bagno in un solvente. Quello che ne esce è un estratto grezzo: un miscuglio in cui convivono ancora centinaia di sostanze diverse.¹ ⁹ Di tutto ciò che Barclay ha spedito, è l'estratto della corteccia, il lotto PR-4960, a mostrare una certa tossicità per le cellule del test: cellule umane coltivate in laboratorio, siglate KB e provenienti da un tumore della bocca. Le prove sugli animali diedero risultati contrastanti; a confermare l'attività antitumorale furono nuove prove sulle KB.¹ ⁹

L'8 settembre 1964 Barclay torna nello stesso punto della foresta dove qualche anno prima aveva raccolto i suoi primi campioni, e questa volta non si accontenta di un sacchetto: se ne va con quasi quattordici chilogrammi di corteccia.¹

E qui la storia prende una piega controintuitiva: nessuno voleva quel campione. La sua citotossicità era troppo alta, e all'epoca circolava la convinzione che un buon candidato antitumorale dovesse essere citotossico, ma non troppo: un veleno indiscriminato ammazza anche le cellule sane. Il laboratorio di Morris Kupchan, allora più autorevole di quello di Wall, lasciò perdere.² Monroe E. Wall, che dirigeva il Natural Products Laboratory del Research Triangle Institute, in Carolina del Nord, non condivideva quel pregiudizio, veniva dall'esperienza con la camptotecina, un altro veleno estratto dalla pianta Camptotheca acuminata che si era rivelato un buon antitumorale, e chiese che il materiale fosse inviato a lui.¹ ²

Wall affida il lavoro a Mansukh C. Wani, chimico organico originario di Bombay, con la reputazione di saper lavorare su quantità minime di materiale. Il lavoro richiede tanta pazienza. Si separa l'estratto in frazioni, si prova ciascuna frazione sulle cellule tumorali, si conserva solo la frazione che continua a uccidere e si riparte dividendo quella. Avanti così, finché in mano non resta una sola sostanza.¹

Nel settembre 1966 arriva il cristallo. È la sostanza che i due siglano K172 e che Wall decide di battezzare taxol: "tax" dal nome del genere Taxus, "ol" perché era già chiaro che la molecola portasse gruppi ossidrilici, coppie ossigeno-idrogeno (–OH).¹

Avere il cristallo in mano, però, non significava conoscere la sua struttura molecolare. All'inizio del 1967 Wani deve ammettere il primo fallimento: non riesce a caratterizzare il composto, cioè a stabilire com'è fatto, e non riesce nemmeno a determinarne il peso molecolare, quanto pesa una singola molecola. Wall gli dice di lasciar perdere il tasso; Wani non obbedisce del tutto e continua a lavorarci "a bassa priorità". Serviranno cinque anni e tre tecniche: la spettrometria di massa, che pesa la molecola e i suoi frammenti; la cristallografia a raggi X, che ne ricostruisce la forma tridimensionale dal modo in cui un cristallo devia i raggi; e la risonanza magnetica nucleare, allora ai suoi inizi, che rivela come gli atomi sono collegati tra loro. Ne esce la formula esatta, C₄₇H₅₁NO₁₄ ovvero quarantasette atomi di carbonio, cinquantuno di idrogeno, uno di azoto, quattordici di ossigeno, e la scoperta che il taxol è in realtà due molecole in una: un grande corpo centrale e una piccola catena laterale. La struttura molecolare viene pubblicata soltanto nel 1971.¹ ¹⁰

E c'è un secondo ostacolo, quello che rischia di far fallire questa interessante molecola: la resa, la quantità di sostanza pura che si ricava dal materiale di partenza, è microscopica, ed estrarla uccide l'albero.

I tassi impiegano circa 200 anni per raggiungere la maturità e un chilo di corteccia contiene appena quattro milligrammi di taxol.¹¹ Tradotto in termini clinici: per curare una sola paziente servivano da tre a sei tassi centenari.¹² E la corteccia non è una risorsa rinnovabile: scorticato, l'albero muore.¹ ¹¹ La salvezza delle malate non poteva significare la distruzione di quelle foreste.

Perché allora i chimici non potevano costruirlo da zero in laboratorio, come si fa con l'aspirina?

Perché il Tassolo è un incubo di complessità architetturale. Se l'aspirina è un casolare a una stanza, il Tassolo è una cattedrale gotica su quattro piani, piena di travi incrociate e angoli impossibili. Il suo nucleo è un sistema di quattro anelli fusi: quattro anelli saldati l'uno all'altro, composti rispettivamente da sei, otto, sei e quattro atomi. E porta 11 centri stereogenici, sette dei quali contigui, cioè uno accanto all'altro. Un centro stereogenico è un punto in cui gli atomi possono disporsi in due modi speculari, come una mano destra e una sinistra: sbagliarne uno non dà un farmaco un po' meno efficace, dà una molecola diversa e di norma inattiva.¹³ L'anello centrale è un cicloottano, otto atomi di carbonio chiusi in cerchio, notoriamente difficilissimo da formare per via sintetica, cioè partendo da zero in laboratorio.¹³

Ma il modo in cui uccide le cellule tumorali è un piccolo capolavoro di sabotaggio cellulare. Quando una cellula si divide, tira su un'impalcatura temporanea di tubi proteici, i microtubuli, per afferrare i cromosomi e ripartirli tra le due cellule figlie; finito il lavoro, deve smontarla. La maggior parte dei chemioterapici dell'epoca impediva alla cellula di montarla: teneva i tubi separati, incapaci di agganciarsi l'uno all'altro, così che l'impalcatura non venisse su.¹ Nel 1979 Susan Band Horwitz, all'Albert Einstein College of Medicine di New York, dimostra che il taxol fa l'esatto contrario: ne stimola la formazione e poi la stabilizza, impedendone lo smontaggio.¹ ¹⁴ L'impalcatura non si può più togliere, la divisione si blocca, la cellula muore.

Restava il problema dell'approvvigionamento. E la soluzione arrivò dalla Francia con la semisintesi, cioè non costruire la molecola da zero, ma partire da una che la natura ha già assemblato quasi del tutto e completarla in laboratorio.

Al CNRS di Gif-sur-Yvette, il centro di ricerca pubblico francese, Pierre Potier lavorava su una specie che cresceva abbondante nel campus e nei vivai dei dintorni: il tasso comune europeo, Taxus baccata, l'albero delle siepi e dei parchi, che si può potare senza ucciderlo. Nel 1981 il suo gruppo isola dagli aghi, che nel tasso sono le foglie, appiattite e sottili come lame, una molecola dal nome impronunciabile, la 10-deacetilbaccatina III, abbreviata in 10-DAB.¹⁵ È presente allo 0,1% del peso secco di aghi e rametti, un grammo per chilo di materiale essiccato, e contiene già otto degli undici centri chirali del taxol: in pratica il corpo della cattedrale già montato dalla natura, raccoglibile senza abbattere niente.¹¹ Ai chimici restava da costruire la guglia laterale e attaccarla, e nel 1988 il gruppo di Potier, con Jean-Noël Denis e Andrew Greene, pubblica il procedimento che rende l'operazione efficiente e praticabile su larga scala.¹⁶

Nell'agosto del 1989 l'istituto mise a bando un accordo di ricerca e sviluppo cooperativo, da assegnare all'azienda con la proposta migliore. Nello stesso anno il finanziamento andò a Bristol-Myers, che di lì a poco si sarebbe fusa con Squibb, un altro colosso del settore; l'accordo fu firmato nel gennaio 1991.¹ ¹⁷ Per la produzione, l'azienda acquistò dalla Florida State University la licenza del procedimento semisintetico messo a punto da Robert Holton.¹

Il 29 dicembre 1992 la FDA approvò il Taxol® per il carcinoma ovarico refrattario.¹⁸ Erano passati trent'anni dalla mattina in cui Barclay aveva raccolto trecentoquaranta grammi di corteccia in una foresta dello stato di Washington, e ventuno dalla pubblicazione della struttura. Seguirono le autorizzazioni per il tumore al seno e per il sarcoma di Kaposi associato all'AIDS.¹

Il nome, intanto, cambia natura giuridica. "Taxol" era il nome che Wall aveva dato alla molecola in laboratorio; diventato marchio registrato di Bristol-Myers Squibb, il composto ha bisogno di una denominazione comune, il nome generico che chiunque può usare, e la comunità scientifica adotta paclitaxel.¹

Nel 2002 BMS abbandona del tutto la via semisintetica, undici trasformazioni chimiche, tredici solventi (i liquidi in cui le sostanze vengono sciolte e separate) e tredici reagenti organici, i composti a base di carbonio che partecipano alle reazioni, e passa alla fermentazione di cellule vegetali.¹¹ ¹⁹ ²⁰ Oggi il paclitaxel si produce a partire dai calli di una linea cellulare di tasso: i calli sono gli ammassi di cellule indifferenziate che una pianta forma anche per cicatrizzare una ferita. Si propagano in un mezzo interamente acquoso, un brodo di sola acqua e nutrienti, senza solventi, dentro grandi fermentatori, le vasche d'acciaio in cui si coltivano organismi su scala industriale, a temperatura e pressione ambiente, nutriti con zuccheri, amminoacidi, vitamine e oligoelementi, i minerali che servono in tracce minime.¹¹

Nel 2004 quel processo ha vinto il Presidential Green Chemistry Challenge Award, il premio della presidenza americana per la chimica verde, nella categoria Greener Synthetic Pathways, "vie di sintesi più verdi". La motivazione dell'EPA, l'agenzia federale statunitense per l'ambiente, è un bilancio in negativo, nel senso migliore: nei primi cinque anni di produzione, circa 32 tonnellate di sostanze pericolose evitate, dieci solventi in meno, sei fasi di essiccamento in meno. E nessun albero sacrificato.¹¹

Riferimenti

1. American Chemical Society, Discovery of Camptothecin and Taxol — National Historic Chemical Landmark, dedicato il 23 aprile 2003 presso il Research Triangle Institute. https://www.acs.org/education/whatischemistry/landmarks/camptothecintaxol.html

2. N. B. Cech, N. Oberlies, From plant to cancer drug: lessons learned from the discovery of taxol, «Natural Product Reports» 40 (2023) 1153. DOI: 10.1039/D3NP00017F

3. Barclay, Arthur Stewart (1932–2003), JSTOR Global Plants — Biographies of Plant Collectors; Arthur S. Barclay Collection, University of Central Florida Special Collections (nato il 5 agosto 1932; laurea all'University of Tulsa nel 1954, master nel 1958 e dottorato in botanica a Harvard nel 1959); USDA Botanist Arthur Barclay Dies, «The Washington Post», 16 novembre 2003. Nota: alcune fonti divulgative indicano Barclay come trentaduenne nell'agosto 1962, dato incompatibile con la data di nascita documentata.

4. V. T. DeVita Jr., E. Chu, A History of Cancer Chemotherapy, «Cancer Research» 68 (2008) 8643–8653; National Academies of Sciences, Federal Agency Roles in Cancer Drug Development from Preclinical Research to New Drug Approval (2005), cap. 2 — i cinque milioni di dollari stanziati dal Senato nel 1955, su pressione di Mary Lasker, per l'istituzione del Cancer Chemotherapy National Service Center.

5. C. R. Wilson, J.-M. Sauer, S. B. Hooser, Taxines: a review of the mechanism and toxicity of yew (Taxus spp.) alkaloids, «Toxicon» 39 (2001) 175–185. DOI: 10.1016/S0041-0101(00)00146-X; Royal Botanic Gardens Kew, Plants of the World Online, voce Taxus baccata L. — gli alcaloidi taxinici sono presenti in tutte le parti della pianta tranne l'arillo e agiscono sui canali ionici delle cellule cardiache.

6. Punta di lancia e arco: American Chemical Society, cit. (nota 1). Sull'identificazione dell'arco di Ötzi come Taxus baccata, lungo 1,82 m e datato al 3300 a.C.: European Yew and Other Woody Species Used for Making Bows: An Assessment Based on Wood Anatomy and History (rassegna di anatomia del legno e storia dell'arco).

7. C. L. Bolsinger, A. E. Jaramillo, Taxus brevifolia Nutt., in Silvics of North America, USDA Forest Service (il tasso del Pacifico raramente supera i 15 m di altezza e i 60 cm di diametro, ed è specie del sottobosco); Western Yew (Taxus brevifolia), Mount Rainier National Park Nature Notes, vol. XVI (1938) — aghi piatti lunghi fino a 2 cm, corteccia esterna sottile, bruno-rossastra, che si sfalda in placche. Nota: la scheda ACS indica aghi "di circa un pollice" (2,5 cm), valore al limite superiore dell'intervallo botanico.

8. Missouri Botanical Garden, The Story of Taxol — i tre quarti di libbra (circa 340 g) di corteccia del fusto raccolti nel 1962.

9. B. J. Abbott, J. L. Hartwell, J. Leiter, R. E. Perdue Jr., S. A. Schepartz, Screening data from the Cancer Chemotherapy National Service Center screening laboratories: plant extracts, «Cancer Research» 26, parte 2 (novembre 1966), p. 1302 e segg. — rapporto ufficiale del programma: l'estrazione era affidata per contratto alla Wisconsin Alumni Research Foundation; il materiale veniva finemente macinato ed estratto con alcol o in acqua e il filtrato liofilizzato in polvere; i campioni erano saggiati su un test in vitro (cellule KB) e tre tumori murini (Sarcoma 180, Adenocarcinoma 755, Leucemia L1210).

10. M. C. Wani, H. L. Taylor, M. E. Wall, P. Coggon, A. T. McPhail, Plant Antitumor Agents. VI. The Isolation and Structure of Taxol, a Novel Antileukemic and Antitumor Agent from Taxus brevifolia, «Journal of the American Chemical Society» 93 (1971) 2325–2327. DOI: 10.1021/ja00738a045

11. U.S. Environmental Protection Agency, Presidential Green Chemistry Challenge: 2004 Greener Synthetic Pathways Award — Bristol-Myers Squibb Company. https://www.epa.gov/greenchemistry/presidential-green-chemistry-challenge-2004-greener-synthetic-pathways-award

12. K. M. Witherup et al. (1990), dato ripreso in US Patent 5,407,816, Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species: da tre a sei tassi del Pacifico centenari per paziente, con rese medie intorno allo 0,01% su corteccia e aghi secchi.

13. W.-D. Li et al., Strategies and Lessons Learned from Total Synthesis of Taxol, «Chemical Reviews» (2023). DOI: 10.1021/acs.chemrev.2c00763

14. National Cancer Institute, Discovery: Natural Compound Offers Hope (storia del Taxol). https://www.cancer.gov/research/progress/discovery/taxol

15. P. Potier et al., «Comptes Rendus de l'Académie des Sciences» 293, serie II (1981) 501 — isolamento della 10-deacetilbaccatina III dalle foglie di Taxus baccata; riferimento citato in US Patent 5,874,595. Per il contesto del gruppo del CNRS di Gif-sur-Yvette e l'avvio degli studi nel 1981: voce Baccatin III, ScienceDirect Topics.

16. J.-N. Denis, A. E. Greene, D. Guénard, F. Guéritte-Voegelein, L. Mangatal, P. Potier, A Highly Efficient, Practical Approach to Natural Taxol, «Journal of the American Chemical Society» 110 (1988) 5917–5919. DOI: 10.1021/ja00225a063

17. Battle Over Generic Taxol Concludes, But Controversy Continues, «JNCI: Journal of the National Cancer Institute» 94 (2002) 324 — accordo di cooperazione NCI–Bristol firmato nel gennaio 1991.

18. S. B. Horwitz, A Personal Story of the Discovery and Development of Taxol (PMC3980006) — approvazione FDA del 29 dicembre 1992 per il carcinoma ovarico refrattario.

19. P. G. Mountford, The Taxol® Story — Development of a Green Synthesis via Plant Cell Fermentation, cap. 7 in P. J. Dunn, A. S. Wells, M. T. Williams (a cura di), Green Chemistry in the Pharmaceutical Industry, Wiley, 2010. DOI: 10.1002/9783527629688.ch7

20. Paclitaxel Production Update, «Chemical & Engineering News» 88 (2010), n. 45 — la decisione di Bristol-Myers Squibb del 2002 di interrompere la via semisintetica.